非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒操作步骤

  兽用

【兽药名称】

通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

汉语拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名称：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名称：无

【主要成分与含量】

【作用与用途】  用于血液、血球粉、淋巴结、脾脏、扁桃体中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】

1 用法

1.1 样品处理

血液样品直接用；淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1万单位青霉素和1万单位链霉素）用MixMax漩涡振荡器混匀（样品不足2.0 g按1:5比例加PBS），对处理的待检样品置70℃，30分钟灭活后，3 000 r/min，4 ℃离心5分钟，取上清液，编号备用；血球粉处理同上，只不过省掉研磨步骤。

1.2 样品存放

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

1.3 操作步骤

1.3.1 病毒DNA的提取（使用A盒）

（1）待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌的1.5 mL离心管，逐管编号。

（2）每管加入Buffer A 500 mL。

（3）每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200 mL，充分混匀，室温放置10分钟。

（4）取与上述离心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，编号。将离心管中的溶液转移至DNase-Free吸附柱，（为避免堵塞吸附柱，尽量不要吸悬浮杂质）。

（5）用TH-15高速离心机设置13000 r/min室温离心30秒。

（6）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。

（7）吸附柱内加入600 μL Buffer B，13000 r/min离心30秒。

（8）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。

（9）重复步骤（7），（8）。

（10）13000 r/min空柱离心2分钟，去除残留液。

（11）将每个吸附柱分别移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入50 μL Buffer C，室温静置1分钟，13000 r/min离心30秒，离心管中液体即为模板DNA。获得的DNA溶液，冰上保存备用（注意提取的DNA须在2 h内进行PCR 扩增，若需长期保存须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融）。

1.3.2 荧光PCR扩增（使用B盒）

（1）从试剂盒中取出荧光PCR反应液、Taq酶，室温融化后，2 000 r/min离心5秒。设所需PCR管数为n（n = 样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要20 μL 荧光PCR反应液和0.5 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装20 μL。

（2）分别向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制备的DNA溶液各5μL，盖紧管盖，500 r/min 离心30秒。

（3）将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。反应参数设置：

阶段，预变性95℃/3分钟

第二阶段，95℃/15秒，52℃/10秒，60℃/35秒共45个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。

2 判定

2.1 结果分析条件的设定

阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的高点为准。对于多通道荧光PCR仪，选定FAM(465-510)检测通道读取检测结果，ABI仪器选择FAM无荧光淬灭基团。

2.2 质控标准

2.2.1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

2.2.2 阳性对照的Ct值应小于等于28，并出现典型的扩增曲线。

2.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

2.3 结果判定

2.3.1 阴性：无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。

2.3.2 阳性：Ct值≤38.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。

2.3.3 Ct值大于38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。

【注意事项】

1 实验室应至少分三个区：样品处理区、反应混合物配制区和检测区。

2 各区物品均为，不得交叉使用，避免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁。

3 Buffer A有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣服上，否则应立即用大量清水冲洗并擦干。

4 在整个检测过程中应注意避免交叉污染：提取核酸时应用灭菌的镊子夹取离心管；对离心管开盖时应避免粘在手上或溅出，否则要立即更换手套。

5 反应液在使用前要*融化，并将反应液与Taq酶瞬时离心将液体甩至管底。分装反应液时，应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

6 阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡1～2秒。

7 试剂盒中各组分应避免反复冻融。

8 对样品及其废弃物的操作应严格遵守生物安全规定。

9 本试剂盒仅供兽医及相关专业人士使用。

【贮藏与有效期】  非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的A盒室温保存，B盒在-20℃保存，有效期为12个月。

【规格】  48检测/盒